Page 16 - Biopsia Liquida

La marcatura con barcode molecolari permette il sequenziamento con- 16
temporaneo di campioni provenienti da diversi pazienti.

L’impiego di pannelli di NGS consente una migliore interpretazione
di indagini eventualmente negative per mutazioni driver di interesse. In-
fatti, l’individuazione di almeno una variante genica nella biopsia liquida
rappresenta la prova della presenza di ctDNA e consente di refertare con
maggiore sicurezza un risultato negativo per la mutazione di interesse.

Le due tecnologie con maggiore diffusione sono prodotte da Illumina
(San Diego, CA, USA) e da Thermofisher (Ion Torrent, Waltham, MA, USA).
La prima prevede la fissazione e l’amplificazione clonale in situ delle mo-
lecole di DNA su sottile supporto vitreo. Nella seconda il DNA è separato e
amplificato in gocciole lipidiche e quindi distribuito in pozzetti microscopi-
ci al fondo dei quali vi è un sottile chip semiconduttore. In entrambi i casi
il pool delle singole molecole di DNA da sequenziare è chiamato library.
La library è generata da amplificazione selettiva delle regioni target con
reazioni PCR multiple oppure con la tecnologia hybrid capture con DNA
baits (esche).

L’uso della NGS per la biopsia liquida richiede modifiche dei proto-
colli normalmente usati per analisi su sangue e tessuti. Il tasso di errore
dell’NGS varia da 0,1 a 1% quindi, ad esempio, una mutazione con una
frequenza allelica sotto tale soglia non può essere differenziata dal cosid-
detto “rumore di fondo”. I protocolli operativi dedicati alla biopsia liquida
riducono il tasso di errore. Un esempio classico di tale modifica è l’incor-
poramento di uno specifico identificatore molecolare prima della fase di
amplificazione del DNA.

Sono state sviluppate tecniche ultrasensibili di NGS dedicate all’analisi
del ctDNA. Il Cancer Personalized Profiling by deep Sequencing (CAPP-Seq)
ha come elemento caratterizzante un selettore che identifica diverse clas-
si di mutazioni somatiche con sensibilità e specificità superiori al 90%.
Risultati simili in termini di sensibilità e specificità sono stati raggiunti con
le tecniche Tagged-amplicon deep sequencing (Tam-Seq) e Safe-Sequen-
cing System (Safe-SeqS).

In conclusione, la tecnica NGS per lo studio del ctDNA per quanto sen-
sibile e specifica è ancora molto costosa e richiede un flusso di lavoro
complesso da parte di personale altamente specializzato. L’uso in clinica
di pannelli multigene su questa matrice biologica richiede, inoltre, l’uso di
software sofisticati e, talora, l’ausilio di bioinformatici.

È quindi evidente che la scelta tra le diverse tecnologie deve tenere
conto della loro sostenibilità e dell’uso clinico richiesto nel contesto in cui
si opera.